吸收放散试验
01
吸附(收)试验
通过红细胞的吸附能够去除血清中相应的抗体。将血清与细胞混合，细胞与血清中的相应抗体结合，然后移出红细胞，理论上血清中有活性的相应抗体都将被去除。吸附(收)试验的应用，简单概括如下：
（1）血清中特异性抗体的分离。
（2）抗体特异性的确定。
（3）人多克隆定型试剂的制备。
（4）确认红细胞上存在和缺失的弱抗原。
因为吸附(收)试验的目的是要去除血清中全部有活性的相应抗体，所以吸附(收)试验与凝集试验相比需要更高的细胞和血清体积比。比较好的比例是1体积细胞：1体积待吸附血清。
02
放散试验—概述
只要抗体已经与相应的红细胞结合，无论是体内致敏，还是体外凝集，或者在其他任何固相基质中，抗体都可以通过一种称为洗脱的过程从红细胞上解脱下来，这种洗脱过程又称为放散。放散抗体后的洗脱液中含有洗脱下来的抗体，这一洗脱液称为放散液。在血清学中抗体放散技术是一项非常有价值的实验技术，应用简介如下：
（1）鉴定血清中特异性抗体。
（2）鉴定抗体的特异性。
（3）定型试剂的制备。例如，应用一组O和A红细胞检测吸附(收)放散后的抗体，如果抗体与O红细胞吸附，则含有目的抗体的放散液中不含有抗A。
（4）鉴定红细胞标本具有的弱抗原。
（5）鉴定引起新生儿溶血病的抗体。
（6）鉴定引起输血反应的抗体。
（7）研究溶血性贫血病人体内的抗体。
（8）生物化学研究中抗体的纯化。
抗体放散试验要求完全解离抗原抗体复合物，这样才会获得完整的游离抗体分子。抗体放散多数会导致反应体系中红细胞的溶血。
John Judd,1972年英国伦敦约翰·凯斯学院生物医学研究所研究员,1974年美国密歇根大学病理学系免疫血液学教授、参比实验室主任，2008年退休。曾任AABB董事会董事、MABB董事会主席，曾获美国血库协会奖、邓斯福德纪念奖和约翰·艾略特纪念奖等。
现在已经设计出多种抗体放散方法。Judd 详细地介绍了16种，并将它们分为四组。第一组：用于冷反应抗体的释放，放散反应对温度要求跨度较大的抗体的释放。这些方法尤其适用于从患有新生儿溶血病婴儿的红细胞中回收抗体。第二组：这些方法特别适用于回收通过获得性免疫和自身免疫产生的无肉眼可见凝集的热反应性IgG 抗体。第三组：用于释放与免疫球蛋白结合的致敏红细胞中的抗体，但是会使多数红细胞溶血，这样就丢失了用于自体吸附反应的红细胞。第四组：适用于从固相基质中洗脱抗体，比如葡萄球菌蛋白A柱，主要应用于抗体纯化。
自从Judd详细地总结了多种放散方法以来，对抗体放散技术的评述仅限于讨论各种方法的特殊应用和一些基本原理的阐述。热放散试验方法和冻融试验方法尤其适用于回收冷反应抗体。因此，将这两种方法应用在ABO血型系统新生儿溶血病的研究中是非常有价值的。热放散试验通过提高水浴温度从而影响抗原抗体复合物的放热反应，最终导致抗原抗体复合物的解离。冻融放散试验通过将吸附(收)后的细胞快速冷冻和融化，形成的冰晶改变了细胞内外的渗透压，导致细胞收缩、溶血并释放抗体，如同破坏了抗原抗体复合物之间的互补结构。声裂放散试验与冻融放散试验相似，微波放散试验与上面提到的热放散试验相似。超声波改变了液体内压，形成气泡，并最终爆裂，产生的震荡波使抗体分子与抗原分离。
放散试验中应用有机溶剂，如乙醚、氯仿、二甲苯、二氯甲烷非常有利于回收获得性和自体产生的热反应性IgG类抗体。应用有机溶剂的机制考虑以下几个方面：①有机溶剂可能破坏了细胞膜脂质双分子层；②有机溶剂可能改变了抗体分子肽链的三级结构；③有机溶剂可能部分改变了抗原抗体之间的吸引力。尽管在放散试验中应用有机溶剂是十分高效的，但是，由于有机溶剂的可燃性、毒性和致癌性限制了它们的应用。不过现在其他的放散技术也是非常有效的并且适合于常规应用。抗体放散试验早期曾经广泛应用洋地黄皂苷酸放散技术。洋地黄皂苷酸放散法的原理是通过调节酸的pH使抗原和抗体分子都带上负电荷，依据同性电荷相排斥的原理而分离抗原抗体。许多其他方法同上面提到的相似，都是通过酸的pH系统使抗原抗体之间的连接键断裂从而释放抗体，其中包括一种从胎盘组织回收抗体的实验设计，胎盘组织含有大量的抗体，是非常有价值的抗体源但经常被忽略。现在已经对各种放散方法的效率进行了比较，结果已经发表，不能说哪一种方法是最好的。有研究者倾向于应用有机溶剂乙醚法，他们认为其他方法都缺乏更好的一致性。直到临床实验室基本禁用乙醚为止，他们一直在研究有机溶剂乙醚法。
放散试验的程序设计主要是回收红细胞上结合的目的抗体。因此，放散试验中红细胞的破坏不会产生严重的不利影响，尽管红细胞的破坏可能导致血红蛋白污染。应用DAT试验研究病人血清中自身抗体的吸附是非常必要的。为了发现和识别同时存在于病人血清中的获得性抗体，放散试验需要进行一些小的调整。也就是说，利用放散试验去除病人红细胞上大量(不需要的)自身抗体，然后用放散后的红细胞吸附(收)病人血清中自身抗体，从而达到去除血清中自身抗体的目的。显然，这样就要求保持放散后红细胞的完整性。可能前面介绍的第一种方法热放散技术可以实现上述要求。热放散试验是将致敏的细胞在水浴中作用足够的时间，这样不但可以释放抗体而且放散后会保留一些完整的红细胞。目前也有一些其他方法可以代替热放散技术用于去除抗体而保留大量完整的红细胞。Edwards 等介绍了二氯喹磷酸盐法，他们认为，中和氨基酸上的电荷可以保持抗体分子的三级结构，并使抗体从红细胞上完整地分离而不破坏红细胞。Branch和Petz介绍了ZZAP在放散试验中的应用，有活性的木瓜蛋白酶和二硫苏糖醇混合物降解了红细胞与IgG抗体之间的连接键，但不破坏红细胞。与二氯喹磷酸盐法不同，用ZZAP处理红细胞会破坏细胞表面Kell系统的全部抗原和敏感的蛋白水解酶。而多数研究人员都希望应用二氯喹磷酸盐法和ZZAP法从自体红细胞中去除自身抗体并将放散后的自体红细胞用于血清中自身抗体的吸附。
Hanfland介绍了一种方法，通过应用不连续的、密度和pH梯度相结合的离心沉淀法处理IgG致敏的红细胞，从而使抗体和红细胞分离。Hanfland放散法与二氯喹磷酸盐法和ZZAP法相比较，前者去除抗体的效率更高。Hanfland放散试验有一些特殊的要求，比如加入的样本体积，预冷的移液管和试管、角架等。Hanfland放散技术不属于血站工作人员熟悉的细胞表面自身抗体分离技术的范畴，Hanfland放散试验操作中的每一个偏差都会降低抗体的回收率，这一成熟技术是由生化学家Peter Hanfland发明的。
03
证明弱A或弱B血型的吸收放散试验
（1）原理：表达弱A或弱B抗原的红细胞与相应抗体反应不出现凝集现象。但吸收相应的抗体，并且可以将其放散出来。检测和鉴定该放散出来的抗体，可以证明弱A或弱B抗原的存在。
（2）试剂：①人血清抗A和(或)抗B(多克隆抗体);或者是单克隆抗A和(或)抗B试剂［一定注意：并不是所有单克隆抗A和(或)抗B试剂均适用于吸收放散试验，只有经过系统鉴定、严格选择出来的少数抗A和(或)抗B单克隆抗体试剂可用于吸收放散试验］。②放散液：生理盐水配制的6%牛血清白蛋白。③生理盐水洗液。
（3）程序：
①生理盐水洗涤1mL压积红细胞至少3遍，最后一次洗涤后，彻底倾去上清。
②如怀疑是弱A抗原红细胞，加入1mL抗A；如怀疑是弱B抗原红细胞，加入1mL抗B至洗涤过的压积红细胞中。
③将红细胞与抗体试剂充分混合，在4℃孵育1h，不时地轻轻摇动试管，混合红细胞与抗体。
④离心，去除所有上清(试剂)。
⑤将红细胞转移到另一干净试管中。
⑥用较大体积(10mL或更多)4℃生理盐水洗涤红细胞至少8遍。保存最后一遍洗涤离心后的上清，检测其中是否存在游离抗体。
⑦应用适当放散方法，如热放散收获ABO抗体。
a. 将与压积红细胞等体积的6%牛血清白蛋白加入试管中。
b. 轻轻混匀红细胞，置56℃水浴中10min，不时地轻摇试管。
c.900～1000×g离心2～3min，最好应用能加温的离心机，或离心套筒中有预热的蒸馏水。
d. 立即将放散液(上清) 转移到另一干净试管中。
⑧检测放散液，同时将第6步留下的最后一遍离心洗涤后上清做平行对照：取3人份O型红细胞，3人份A型或B 型红细胞(根据怀疑是A或B型弱抗原红细胞而定)；2滴放散液加1滴红细胞(对照是上清2滴加1滴红细胞)；然后，立即分别离心并观察血凝；或37℃孵育15min 后，离心，观察血凝；如仍无凝集，应用间接抗人球蛋白方法检测。
（4）解释：
①如果：
a. 放散液与3份抗原阳性红细胞反应
b. 与3份O型红细胞不反应
c. 最后一遍洗液与所有6份红细胞不反应，则放散液中存在抗A或抗B，被检测的弱A或弱B红细胞上被证明有A或B抗原。
②如果放散液不与A或B红细胞反应，可能是受检红细胞无弱A或弱B抗原，不吸收相应抗体，也可能是放散试验失败。
③如果放散液与部分A或B红细胞，同时与部分O细胞都反应，提示经该吸收/放散试验收获了其他特异性的抗体。
④如果洗液(对照)与A或B细胞反应，该放散试验无效。其原因可能是在放散前，游离的试剂抗体未被洗净，也可能是洗涤过程中结合的抗体被解离至洗液中。
04
热放散技术
热放散法要求水浴箱的温度为56℃。
（1）操作：
①至少用缓冲盐水洗涤6次待检细胞，按要求保留最后一次洗涤液。
②向压积红细胞中加入等体积的6%w/v牛血清白蛋白缓冲水溶液。
③将细胞在56℃孵育10min。每隔 15～30s摇动混悬一次。
④在最短时间内高速离心细胞悬液(750～1000r/min)，将红细胞和上清液完全分开。
⑤立即对上清液，及最后一次洗涤液做平行实验。
⑥检测放散液，并和最后一次洗涤液做平行实验。
（2）注释：
步骤④容易因冷而使已被放散出的抗体再次与红细胞结合。如果需要检测放散后的细胞血型，最好用45℃代替56℃，放散时间可以延长到至少15min。
05
甘氨酸-盐酸/EDTA放散技术
（1）材料：
①EDTA二钠(10%w/v):Na2EDTA2H2O 10g加蒸馏水到100mL。
②甘氨酸-HCl(0.1mol/L pH1.5):用500mL蒸馏水溶解 3.754g甘氨酸 2.922g NaCl，用 12N调pH到1.5，4℃保存。
③Tris base:12.1g Tris base加蒸馏水到100mL。
④用盐水洗过6次的DAT阳性压积红细胞。
⑤最后一次洗涤红细胞的盐水上清。
（2）方法：
①将4mL甘氨酸-盐酸和1mL EDTA混合在一支16mm×100mm的检测管中。
②立即加1mL洗过的红细胞，混匀。
③室温孵育1～2min。
④以900～1?000×g离心力离心2～3min。
⑤将放散液上清移到一支干净的试管中，并用1mol/L Tris base调pH到7.5。
⑥混匀并以900～1000×g离心力离心2～3min。
⑦将放散液上清移到一个干净试管中并与最后一次洗涤细胞的盐水上清做平行检测。
（3）注释：
①用Gly-HCl/EDTA处理可使Kell系统抗原变性。
②用Gly-HCl/EDTA修饰过的红细胞也可用蛋白酶处理，在自身吸附研究中应用。
上述内容来源：
李凌波,陈维佳主编.血液免疫学血型相容性实验指南[M].长春：吉林大学出版社,2021.
