新生儿溶血病(HDN) 免疫血液学试验推荐方案（一）
作者：中国医师协会输血科医师分会
通信作者:林园，女，中国医师协会输血科医师分会副总干事，副教授，副主任技师，主要从事临床安全输血研究。
HDN 产前免疫血液学试验推荐方案
一 、检查对象
1.有不良妊娠史、输血史及 HDN 史的孕前妇女；
2.Rh阴性孕前妇女；
3.孕妇血型为O型、配偶血型为非O型者。
二 、标本采集时间
1.怀孕前应进行检查者:
有不良妊娠史、输血史、HDN 史、 Rh阴性妇女；
2.怀孕后应进行检查者:
孕妇血型为O 型、配偶血型为非O型者。
第1次检测：一般在妊娠第12～16周进行，以此作为抗体基础水平。如果检测到ABO 以外抗体，或高效价IgG抗-A (B) ，建议每月复查1次。
第2次检测：在妊娠第28～30周做，以后每隔2～4周测定1次，了解抗体增加速度。抗体效价上升快，提示HDN的可能性大。
3.第2次检测时可以使用第1次冻存的标本做平行对照，有助于排除试验技术和试剂红细胞的干扰。
三、标本要求
1.第1次检测: 采集夫妇双方EDTA抗凝血各3～5ml。
2.复查检测: 采集孕妇EDTA抗凝血3～5ml。
3.如无配偶的血液标本，则无法检测孕妇是否有针对其配偶特有的、低频抗原所产生的免疫抗体。
四、检查项目
1.参照文献[2]
2.夫妇ABO、Rh( D)血型鉴定。
3.孕妇/孕前妇女IgG 抗-A(B)效价检测:
孕(前)妇是O型，配偶是A型或B型，检测女方相应的IgG抗-A( B) 效价; 若配偶是AB型，需检测女方IgG抗-A、抗B效价。
4.孕妇/孕前妇女 ABO 以外抗体检测:
需使用抗体筛选细胞和其配偶红细胞做ABO 以外抗体和针对其配偶特有的低频抗原所产生的免疫抗体的筛选; 筛选阳性者要做抗体特异性鉴定和效价测定。
五、检测方法
1.夫妇 ABO、Rh( D) 血型鉴定:
1) 具体参照文献[1][2]
2) 选用经国家批准且批批检定合格的单克隆抗-A、抗-B、抗-D( IgM) 和 A、B、O 型试剂红细胞。
2.孕妇/孕前妇女 IgG 抗-A( B) 效价检测:
1) 检测器材和试剂:
(1) 血清学离心机，水平离心，可定速定时；
(2) 37℃恒温水浴箱；
(3) 20～200 μl、100～1000μl 移液器；
(4) 10mm×60mm 透明光洁试管；
(5) 抗球蛋白试剂( 广谱、抗-IgG) : 通过生产厂家标定最适稀释度；
(6) A、B血型物质: 配制及标准见参考文献[1];
(7)2-Me 应用液: 2-Me应用液制备: 取2-Me浓缩液1.6ml，用pH7.4的PBS液稀释到100ml，分装安瓿，4℃保存备用; 也可以采用商品应用液；
(8) 2%～5% IgG 抗体致敏的红细胞悬液；
(9)生理盐水。
2) 检测步骤:
(1) 2-Me 法:
Ⅰ 取待检血清 400 μl，加 2-Me应用液400 μl；
Ⅱ 混匀以上中和后血清，密封试管口，37℃ 孵育15～30 min；
Ⅲ 按照以下稀释度，从1∶2，1∶4…到1∶1024，标记2组10mm×60 mm的试管各10个，第11管标记为阴性对照(丈夫是AB型，需准备3组试管) ；
Ⅳ 取1组标记好的试管，从第2管(1∶4) 至第10管(1∶1024) 每管加400μl生理盐水，阴性对照管中加100μl生理盐水；
Ⅴ 第1管(标记为1：2) 和第2管(1：4) 中各加中和后血清400μl。第2管混匀后移出400μl至后1管(1: 8) 。用相同的方法继续倍比稀释，从最后1个试管中取出的400 μl保留备用；
Ⅵ 取每一稀释度的待检血清100μl，加入另1组已标记好的试管中，每个试管中加入2%～5%A(B)型红细胞悬液50μl，900～1000g，离心15s，观察IgM 抗-A(B) 是否中和彻底，记录凝集结果；
Ⅶ 将盐水介质中不出现凝集的管，重新轻轻混匀后做间接抗球蛋白试验。推荐使用试管法。
(2)型物质中和法:
Ⅰ 按照以下稀释度，从 1∶ 2，1∶ 4…到 1∶1024，标记两组10mm × 60mm 的试管各10个，第11管标记为阴性对照(丈夫是 AB 型，需准备三组试管) ;
Ⅱ 取1组标记好的试管，从第2管(1∶4) 至第10管(1 : 1024) 每管加400μl生理盐水，阴性对照管中加100 μl生理盐水；
Ⅲ 第1管( 标记为1 :2) 和第2管(1: 4) 中各加待检血清400μl。第2管混匀后移出400μl 至后1管(1∶8) 。用相同的方法继续倍比稀释，从最后1个试管中取出400μl 保留备用；
Ⅳ 取每一稀释度的待检血清50μl 加在另1组已标记好的试管中，每管中再分别加入已处理过的分泌型唾液50μl，混匀；
Ⅴ 室温孵育30～60min，让血型物质充分中和抗体；
Ⅵ 每个试管中加入2%～5% A( B) 型试剂红细胞悬液50μl，900～1000 g，离心15s，观察IgM抗-A(B) 是否中和彻底，记录凝集结果；
Ⅶ 将盐水介质中不出现凝集的管，重新轻轻混匀后做间接抗球蛋白试验。推荐使用试管法。
3) 结果分析:
(1) 观察凝集结果: 出现1+红细胞凝集最高稀释度的倒数即为效价。如果试验准备的全部试管仍不能达到效价所需要求，则需要继续稀释以达到上述效价标准。红细胞凝集强弱标准请参照参考文献[1]。
(2) 在盐水介质中不凝集，加入抗球蛋白试剂后亦不凝集者，须加入2%～5% IgG抗体致敏红细胞悬液50μl再次离心，以验证阴性结果是否正确。离心后出现凝集，证明阴性结果准确，待检血清中无 IgG抗-A(B)。否则可能是假阴性，必须重新试验。
(3) 在盐水介质中不凝集，加入抗球蛋白试剂后出现凝集者，表示孕妇血清中存在IgG抗-A(B) 。
4) 注意事项:
(1)倍比稀释时注意: 混匀时尽量不要产生气泡，吹/吸干净移液器吸头内残留液体后再进行下一试管的液体混匀。稀释的体积不能太小，否则影响实验的准确性，推荐至少要＞400 μl，(每管加400 μl盐水，第2管加400 μl 血清) 。
(2)型物质中和法的受检者唾液必须经过规范留取和处理后方可使用，具体方法请参照参考文献[1]。
(3) 检测IgG 抗-A(B) 时，盐水试验与抗球蛋白试验的结果要相差两个稀释度，即2管(4倍) 以上才认为结果可靠。否则，需延长2-Me或血型物质的处理时间，重新测定效价。
(4) 目前市场上有商品化的巯基试剂，如2-Me应用液，使用很方便; 但2-Me应用液气味难闻且易挥发，一般现用现配或配制好后分装保存。一旦打开包装应一次性使用完，未用完应丢弃。
(5)血型物质无特殊味道，但使用前需要处理唾液并作筛查和定量修正，过程较繁琐。
(6)也可使用 DTT 代替巯基试剂处理血清，但DTT处理血清成本较高。
(7)酶技术、聚凝胺试验一般不用于效价测定。
(8)注意在不同时间测定孕妇的抗体效价时，必须采用同一方法和同样抗原表型的红细胞进行实验，以便比较。
3 孕妇/孕前妇女 ABO 以外抗体检测:
1) 抗体检测方法可参照参考文献[1]。
2) 用抗体筛选细胞做 ABO 以外抗体筛选; 用其配偶红细胞做针对其配偶特有的、低频抗原产生的免疫抗体筛选。
3)检测是否有针对其配偶特有的、低频抗原所产生的免疫抗体时，当双方ABO血型相合时，可直接将其配偶 2%～5%的红细胞悬液加入孕(前) 妇血清中; 当双方ABO血型不合时，先要排除孕(前)妇血清中IgM抗-A(B)干扰后，再加入其配偶2%～5%的红细胞悬液。
4) 若抗体筛选为阳性结果，需进一步做抗体特异性鉴定和效价测定。
六、试验报告
试验报告至少应包括以下内容:
1. 实验室名称和联系方式;
2. 被检者姓名和唯一性编号;
3. 送检医院;
4. 标本采集日期及实验室接收标本和报告日期;
5. 试验方法;
6. 试验结果;
7. 实验者、复核者签名;
8. 如需复查，复查时间需注明;
9. 参考值范围。
七试验报告参考格式(表1)
文中提及的参考文献：
[1]宋宁，陈静娴，李宏． 新生儿溶血病检测/ /兰炯采，贠中桥，陈静娴． 输血免疫血液学实验技术，北京: 人民卫生出版社，2011:45-57.
[2]Methods section 5． Hemolytic disease of the fetus and newborn∥Roback JD，Combs MR，Grossman BJ，et al． AABB technicalmanual 16th ed． Betheda: AABB press，2008: 935-939．
文献来源：节选自中国输血杂志2012年第25卷第2期95-96页：HDN产前免疫学试验推荐方案
