新生儿溶血病(HDN) 免疫血液学试验推荐方案（二）
作者：中国医师协会输血科医师分会
通信作者:林园，女，中国医师协会输血科医师分会副总干事，副教授，副主任技师，主要从事临床安全输血研究。
HDN 产后免疫血液学试验推荐方案
一 、标本要求
1.参照文献[2]
2.采集标本时间建议:
1) 可疑 ABO 不合 HDN 患儿血清学检查最好在出生后7 d内;
2) 可疑 Rh 等其他血型系统血型不合应在出生后尽早为好。
3.采集标本部位:
静脉血、脐血标本均可。
( 注: 因为母婴 ABO 血型不合的新生儿脐带血大约有20%血清学常规三项试验为阳性，但临床上并无新生儿溶血症状，血清胆红素也未见升高; 若条件允许，产后血液学试验推荐使用静脉血)
4.采集标本量:
1) 父亲抗凝血2ml;
2) 母亲不抗凝血4ml 分离血清抗凝血2ml;
3) 患儿抗凝血＞3 ml; 不抗凝血1ml(如新生儿抽血困难，应尽量保证抗凝血标本) 。
5.抗凝剂选择: EDTA抗凝/枸橼酸钠抗凝。
二 、试剂与设备
1.常用试剂:
1) 血型定型试剂: 抗-A、抗-B、抗-A，B、抗-D 定型试剂，ABO 标准红细胞同《HDN 产前免疫血液学试验》条目。
2) 其他试剂：
(1)生理盐水；
(2)抗球蛋白试剂( 广谱、抗-IgG) : 通过生产厂家标定为最适稀释度；
(3) 1% 菠萝酶试剂: 按参考文献[1]配制；
(4)化学放散试剂: 乙醚或三氯甲烷/三氯乙烯(分析纯) ；
(5)磷酸氯喹放散液、反应增强剂: LISS 或聚乙二醇(商品试剂) ；
(6) A、B血型物质: 配制及标准见参考文献[1]；
(7)人源 AB 型血清: 符合参考文献[1]标准。
2.常用设备及耗材:
1) 血清学专用离心机;
2)恒温水浴箱，可调节56℃、45℃、37℃ ;
3)普通光学显微镜;
4)专用卡式离心机和配套孵育器;
5)20～200 μl、100～1000 μl 移液器;
6)10mm × 60mm 透明光洁试管;
7)2～3 ml一次性塑料滴管;
8)－70℃低温冰箱。
三、检测方法
1.产妇血标本检测:
同《HDN 产前免疫血液学试验》孕妇检测条目。
2.患儿血标本检测:
1) 红细胞: ABO正定型、RhD血型
(1) 操作方法:
Ⅰ 取试管4支，分别注明抗-A、抗-B、抗-A，B、抗-D;
Ⅱ 分别加入抗体试剂，加量参照试剂说明书;
Ⅲ 每支试管加入患儿2%～5% 红细胞悬液50μl;
Ⅳ 1000 g，离心15s，轻轻摇动试管观察结果。
(2)凝集结果判定:
同《HDN 产前免疫血液学试验》凝集结果判定条目。(说明: 新生儿 ABO 定型，多数专家认为反定型无意义)
2) 红细胞直接抗球蛋白试验(DAT) : 检测患儿红细胞上有无致敏的免疫性抗体。
(1) 操作方法:
Ⅰ 将患儿红细胞用盐水洗涤3～4次后，配制2%～5%盐水悬液;
Ⅱ 取试管2支，各加入上述悬液50μl，第1管内加入抗人球蛋白血清(抗-IgG或广谱) 100μl，第2管加盐水100μl，混合后立即以1000 g离心15 s;
Ⅲ 轻轻转动试管，将混悬液倒在玻片上，在低倍显微镜下观察结果。
(2) 结果分析:
Ⅰ 肉眼可见明显凝集，或镜下有3～4个以上红细胞的凝集，均匀分布在游离红细胞之间者为阳性; 无凝集者为阴性。
Ⅱ 患儿红细胞加盐水管应不凝集，若出现凝集，说明细胞本身有自凝现象，试验结果无参考意义。
3) 红细胞放散试验:
进一步验证患儿红细胞上存在致敏的免疫性抗体; 用放散液检测，需用末次洗涤液做平行对照。
(1) 制备浓缩红细胞: 抗凝血标本以1000g离心5～10 min 后分为2层，尽量去除上层的血浆或液体部分，取沉积于试管下部紧实的红细胞(浓缩红细胞)部分备用;
(2) ABO系统采用物理方法(改变温度条件) 放散:
★ 56℃热放散法:
Ⅰ 患儿浓缩红细胞1 ml，置大试管中用10倍量生理盐水充分洗涤3次后，制成浓缩红细胞，加入等量生理盐水，保留末次洗涤液;
Ⅱ 将试管置 56℃水浴中不断振摇 10 min，取出后(如有条件，置预先准备的盛有56℃热水的离心套管内)立即以1000 g离心3～5 min;
Ⅲ 吸取上层放散液(粉红色)备用;
Ⅳ 放散液可用于盐水法和IAT检测抗体。
★ 冰冻放散法:
Ⅰ 患儿浓缩红细胞 1ml，参照 56℃热放散法充分洗涤后制成浓缩红细胞，加入等量生理盐水。保留末次洗涤液;
Ⅱ 混匀，－70℃至－20℃快速冷冻10min;
Ⅲ 取出并放于 37℃充分融化;
Ⅳ 1000 g离心2 min，立即分离上清液得到放散液;
Ⅴ 放散液只能用于IAT检测抗体。
(3) Rh等其他系统采用化学放散法:
★ 三氯甲烷/三氯乙烯法:
Ⅰ 患儿浓缩红细胞1ml，用10倍量生理盐水充分洗涤3次后，制成浓缩红细胞，置大玻璃试管中加等量生理盐水，保留末次洗涤液;
Ⅱ 加入三氯甲烷/三氯乙烯( 等量混合) 放散液2ml;
Ⅲ 用塞子塞紧试管口，用力震摇10s，倒置1min 充分混匀;
Ⅳ 打开塞子，37℃水浴5min，其间摇动数次;
Ⅴ 1000g 离心5min，吸取最上层液体即为放散液(注意不要混入中层或下层液体) 。
Ⅵ 放散液只能用于IAT检测抗体。
★ 乙醚放散法:
Ⅰ 参照三氯甲烷/三氯乙烯法洗涤并制备浓缩红细胞，保留末次洗涤液;
Ⅱ 取浓缩细胞 1ml 转移至大玻璃试管，加生理盐水1ml 混匀后，加乙醚2 ml;
Ⅲ 用塞子塞紧试管口，用力震摇1min，其间取下塞子数次，便于乙醚挥发;
Ⅳ 1000g离心10min。离心后内容物分为3层，上层乙醚(无色) ，中层红细胞基质，下层含抗体的放散液(深红) ;
Ⅴ 吸出下层放散液至另1试管中;
Ⅵ 将放散液置37℃水浴中加热10～30 min，其间摇动数次，便于乙醚彻底挥发;
Ⅶ 1000g离心2min，去除混入放散液中的细胞膜碎片。
Ⅷ 放散液只能用于IAT检测抗体。(注: 使用化学放散法必须将浓缩红细胞和等量的生理
盐水一并转入大的玻璃试管中，再加三氯甲烷/三氯乙烯或乙醚，因为2种化学试剂均为有机溶剂，将会腐蚀塑料试管内壁，影响试验结果)
(4) 放散液抗体检测:
★ ABO系统放散液抗体检测:
Ⅰ 取小试管3支，做好标记，第1管为检测管，加放散液200μl，第 2、3 管为阴、阳性对照，第2管加IgG 抗-D试剂50μl，第3管加AB型血清50μl;
Ⅱ 第1管加2%～5%与患儿ABO同型的标准红细胞50μl，第2、3 管分别加2%～5%的三人份O型RhD(+)混合细胞50 μl，混匀;
Ⅲ 37℃水浴致敏1h;
Ⅳ 取出，用盐水洗3次，最后1次吸干水分，每管加抗球蛋白试剂100μl;
Ⅴ 以1000g，离心15s，肉眼观察结果; 用末次洗涤液做平行试验。
★ Rh 等其他系统放散液抗体检测:
Ⅰ 取小试管5支，1～3管为检测管，4、5管为阴、阳性对照，做好标记，第1～3管分别加放散液200μl，4管加IgG抗-D试剂50μl，5管加AB型血清50 μl;
Ⅱ 1～3管分别加2%～5%的抗体筛选Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号细胞各50μl，4、5 管分别加2%～5%的三人份O型 RhD(+) 混合细胞50μl，混匀;
Ⅲ 以下步骤同ABO系统放散液抗体检测Ⅲ～Ⅴ步骤，用末次洗涤液做平行试验。
4) 患儿血清游离抗体检测:
检测新生儿血清中有无来自于母亲的免疫性抗体。操作方法如下:
(1) 新生儿静脉血标本＞3 ml，分离血清( 血浆) 备用;
(2)ABO系统和Rh等其他系统游离抗体检测方法同放散液抗体检测法，试验管调整血浆加量为100 μl;
(3) 若抗体有特异性，要加测患儿相应抗原。 (注: 由于新生儿血液特点，ABO系统HDN三项试验往往出现极弱的阳性结果，与患儿临床症状不相符; 酶处理红细胞可增强吸收抗体的能力，提高阳性率，此法甚敏感，即使DAT阴性，也有可能得到阳性结果; 试验过程不能忽视阴性对照; 也可在试验中添加等增强剂)
附1 酶处理红细胞增强试验:
Ⅰ 间接酶液配制∶ 1%菠萝酶∶ pH5. 5磷酸盐缓冲液:0. 2% 半胱氨酸盐水溶液，按1∶2∶1混合;
Ⅱ 洗涤1次的浓缩红细胞，加等量间接酶液混合后，置37℃ 10 min，取出后盐水洗涤3次，配成5%红细胞悬液备用。
Ⅲ 做患儿红细胞放散液抗体和血清中游离抗体检测试验，其中的与患儿同型及抗筛试剂红细胞，阴、阳性对照用标准红细胞改用酶处理红细胞即可;
Ⅳ 37℃孵育时间减少至 30 min，其他同原试验。
附2 经典抗球蛋白试验，参照参考文献[1]。
附3 添加低离子强度溶液( LISS) :
Ⅰ 根据试验需要取试剂红细胞适量，以1000 g，离心1 min，去除保养液，用LISS液配制成2%～5% 的红细胞悬液(必须当天使用) ;
Ⅱ 做患儿红细胞放散液抗体和血清中游离抗体检测试验，其中的与患儿同型及抗筛试剂红细胞，阴、阳性对照用标准红细胞改用 LISS 红细胞悬液即可;
Ⅲ 置37℃水浴，孵育30～60 min;
Ⅳ 其他操作步骤同原试验。
附4 添加聚乙二醇溶液:
Ⅰ 加样同放散液和游离抗体检测;
Ⅱ 血清和红细胞悬液混匀后，向试管中添加聚乙二醇，加入量按照试剂说明书;
Ⅲ 置 37℃水浴，孵育15min;
Ⅳ 其他操作步骤同原试验。
5) 结果分析:
(1)阴性对照应无凝集，阳性对照应有3 +～4 +的凝集，也可参照参考文献[1]，取消试验中阴、阳性同步对照，改用抗-D 致敏红细胞对IAT的阴性结果验证;
(2)仅与患儿同型的A或B型红细胞出现凝集，为免疫性抗-A或抗-B;
(3)酶处理红细胞或加入增强剂的阴性对照管应无凝集，否则视为处理过度;
(4)与抗筛细胞和/或同型细胞出现阳性结果，可能存在不规则抗体，推荐使用谱细胞，选择同样试验条件鉴定其特异性;
(5) 根据增加的患儿相应抗原检测，确定免疫性抗体的特异性;
(6) 患儿体内检测到的抗体特异性应与母亲一致，且患儿红细胞相应抗原为阳性; 若母亲体内检测到的免疫性抗体的相应抗原是患儿所没有的，即患儿抗原阴性，应该考虑它来自于以往的妊娠或输血，可以肯定该抗体不是引起本例HDN的原因。
四、ABO 血型不合新生儿三项试验结果分析及提示临床意义(表 2)
五 、实验报告内容及格式(表 3)
文中提及的参考文献：
[1]宋宁，陈静娴，李宏． 新生儿溶血病检测/ /兰炯采，贠中桥，陈静娴． 输血免疫血液学实验技术，北京: 人民卫生出版社，2011:45-57.
[2]Methods section 5． Hemolytic disease of the fetus and newborn∥Roback JD，Combs MR，Grossman BJ，et al． AABB technicalmanual 16th ed． Betheda: AABB press，2008: 935-939．
文献来源：节选自中国输血杂志2012年第25卷第2期96-99页：HDN产后免疫学试验推荐方案
