微柱凝胶抗人球蛋白试验不需洗涤步骤的原因
至今，微柱凝胶抗人球蛋白试验(MG-Coombs’T)已成为检测不完全抗体的血型血清学临床常规检测技术。在毫无异议、充分肯定MG-Coombs’T的前提下，也始终存在着疑问：MG-Coombs’T为什么不需要洗涤？从常识上讲，在MG-Coombs’T的微柱凝胶中，血清中的球蛋白也应该能够中和抗人球蛋白试剂，从而影响抗人球蛋白试剂和红细胞上不完全抗体的连结。文献未见有关实验对此问题的解释报道，我们的实验结果明确解释了此原因。
方法
以蓝色的甲基蓝水溶液在MG-Coombs’T和传统试管Coombs’T中的扩散情况进行分析。
（1）在MG-Coombs试剂卡反应腔中各加入甲基蓝50μL。
（2）离心观察后分三组：各取两张卡分别放入4℃冰箱、室温（20℃）和37℃孵育器中。另三张卡在反应腔中各加入无菌生理盐水50μL,也分三组：同时放入上述温度环境中。
（3）甲基蓝溶液加入后，即刻和离心后观察其在微柱凝胶卡反应腔和分离柱中的扩散情况，每30分钟观察一次，共2小时；再每2小时观察一次，共6小时；过夜后（16小时）再继续观察，每2小时一次，共6个小时。总计30小时。
（4）取出孵育了6小时的卡各1张，将微柱凝胶反应腔中蓝色液体吸出，加入25μL生理盐水，再吸出所有凝胶于试管中，2000转/分钟离心5分钟，取上清。将MG-Coombs试剂卡中取出的上清加入以不完全抗-D致敏的红细胞中（已充分洗涤）。将ABO/RhD血型检测卡中取出的上清分别加入A、B和D阳性红细胞，1000转/分钟离心1分钟。
结果
MG-Coombs试剂卡中加入的甲基蓝在反应腔中很快扩散，但是能够长时间不扩散到凝胶中，保持两相状况。传统的试管Coombs试验加入人血清、红细胞和抗人球蛋白试剂，再加入甲基蓝溶液后即刻全部呈蓝色。
在加入甲基蓝的MG-Coombs试剂卡的反应腔及分离柱中：
（1）液体部分即刻呈蓝色，与凝胶层呈明显分界，凝胶层仍呈原来颜色。离心后观察仍呈两相，见下图。
（2）4℃和室温放置30个小时仍未见蓝色液体扩散至凝胶层，两相界面稳定。同上图。
（3）37℃放置22小时的卡，可见蓝色液体扩散至凝胶层上1/3处，界面略模糊不清。见下图。
实验结果分析
MG-Coombs试剂卡中加入的甲基蓝在反应腔中很快扩散，但是能够长时间不扩散到凝胶中。4℃和室温放置的卡经30个小时，37℃放置的卡超20小时，上层蓝色液体和白色凝胶两相界面稳定。可以说明在MG-Coombs试剂卡中加入人血清后，人血清中的球蛋白长时间不扩散到凝胶中，也就避免了凝胶中的抗人球蛋白试剂被中和消耗。反应腔中甲基蓝扩散在37℃要快于4℃。
在甲基蓝被吸出后，离心凝胶分离的上清仍出现了预期的阳性反应，说明凝胶中的抗体成分经6小时也未扩散到甲基蓝液体中。这6小时是远远长于孵育所需的15分钟的。
未加入甲基蓝的三张卡放置后取出，各孔中加入相应细胞，孵育15分钟后离心，都出现凝集现象，说明阳性对照成立。
结论
MG-Coombs’T简化洗涤步骤的根本原因：由于加入的人血清和含抗人球蛋白试剂的凝胶长时间处于两相状况，相互不扩散，即凝胶中抗人球蛋白试剂并不被人血清中的球蛋白中和及消耗。
由此进一步分析MG-Coombs’T的反应机理。在MG-Coombs试剂卡的微柱上部反应腔中，人血清标本中特异性不完全抗体（Fab）与相应红细胞结合后，在一定的离心力作用下通过分离柱下部凝胶时，相邻的单体红细胞免疫复合物被抗人球蛋白桥连而出现凝集。阴性反应时，红细胞则被沉淀在微柱凝胶管尖底部。
应强调，在MG-Coombs试剂卡的分离柱中含有抗人球蛋白试剂。人血清特异性抗体和非特异性抗体（包括其他免疫球蛋白）都能和分离柱中的抗人球蛋白试剂结合。
分离柱中存在着：
（1）人血清中特异性抗体（Fab）与红细胞抗原结合，抗人球蛋白（Fab）再与人血清中特异性抗体（Fc）结合，表现为颗粒性红细胞免疫复合物。
（2）抗人球蛋白（Fab）结合非特异性抗体（Fc）（包括其他免疫球蛋白），但非特异性抗体并不能结合红细胞，呈可溶性免疫复合物。
以上这两种反应是随机反应，必然是同时存在。该抗人球蛋白和非特异性抗体形成的可溶性复合物对颗粒性免疫复合物（抗人球蛋白-特异性抗体-红细胞）之间的连接形成位阻，因而影响在凝胶卡分离柱中形成凝集反应。
（3）使红细胞沉降需要的离心力一般小于100g, 而抗体等蛋白质复合物分子沉降分离需要的离心力最少是3000g。因此微柱凝胶免疫分析技术中的专用离心机的离心力(<120g )只能使红细胞下降分离，而不能使血清蛋白、抗人球蛋白以及可溶性抗原抗体复合物下降分离。抗人球蛋白-特异性抗体-红细胞颗粒性免疫复合物在离心下降分离过程中，在通过液体和胶体两相界面时，各个颗粒性免疫复合物之间距离缩小，从而较之试管Coombs’T增强了免疫凝集反应性。
作者：李凌波
来源：输血视界
